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扫描电子偏光显微镜样品的制备及关注

发布人:shpuda发布时间:2014/4/23

    扫描电子偏光显微镜观察时要求样品必须干燥,并且表面能够导电。因此,在进行扫描电镜生物样品制备时一般都需采用固定、脱水、干澡及表面被金等处理步骤。


    1.固定及脱水


    生物样品的精细结构易遭破坏,因此在进行制样处理和进行电镜观察前必须进行固定,以使其能最大限度地保持其生活时的形态。而采用水溶性、低表面张力的有机溶液如乙醉等对样品进行梯度脱水,也是为了在对样品进行干操处理时尽最减少由表面张力引起的其自然形态的变化。


    将处理好的、干净的盖玻片.切割成4-6 mm2的小块,将待检而较浓的大肠杆菌悬浮液滴加其上,或将菌苔直接涂上,也可用盖玻片小块黏贴于菌落表面,自然干澡后光学偏光显微镜下镜检,以菌体较密,但又不堆在一起为宜。标记盖玻片小块有样品的一面;将上述样品置于1% -2%戊二旺磷酸缓冲液(pH7.2左右)中,于4℃冰箱中固定过夜。每次用15%的同一缓冲溶液冲洗,用40%,70%,90%和100%的乙醉分别依次脱水,每次15min,脱水后,用醋酸戊醋置换乙醇。


    另一种与之类似的样品制备方法是采用离心洗涤的手段将菌体依次固定及脱水,最后涂布到玻片上。其优点是:①在固定及脱水过程中可完全避免故体与空气接触,从而可最大程度地减少因自然干燥而引起的菌体变形。②可保证最后制成的样品中有足够的菌体浓度,因为涂在玻片上的菌体在固定及干燥过程中有时会从玻片上脱落。③确保玻片上有样品的一面不会弄错。


    2.干燥


    将上述制备的样品置于临界点干燥仪中,浸泡于液态二氧化碳中,加热到临界点温度(31.4℃,7 376.46 kPa,即72.8个大气压)以上,使之气化进行干澡。


    样品经脱水后,有机溶剂排挤了水分,浸占了原来水的位置。水是脱掉了,但样品还是浸润在溶剂中,还必须在表面张力尽可能小的情况下将这些溶刑“请”出去,使样品真正得到干燥。目前采用最多、效果最好的方法是临界点干燥法。其原理是在一装有溶液的密闭容器中,随着m度的升高,蒸发迅速加快,气相密度增加,液相密度下降。当赴度增加到某一定值时,气、液二相密度相等,界面消失,表面张力也就不存在了。此时的沮度及压力即称为临界点。将生物样品用临界点较低的物质且换出内部的脱水荆进行干燥,可以完全消除表面张力对样品结构的破坏。目前用得最多的置换荆是二饭化碳。由于二级化碳与乙醇的互溶性不好,因此样品经乙醉分级脱水后还需用与这两种物质都能互溶的“媒介液一险酸戊陈炭换乙醉。


    3.喷镀及观察


    将样品放在真空镀腆机内,把金喷镀到样品表面后,取出样品在扫描电镜中进行观察。


    试验报告


    1:结果


    绘图描述你所制备的大肠杆菌和pBR322质粒DNA电镜制片在电子偏光显微镜下观察到的形态特点。


    2.思考题


    (1)利用扫描电子显微镜来观察的样品为什么要放在以金属网作为支架的火棉胶膜(或其他膜)上,而扫描电子显微镜则可以将样品固定在盖玻片上观察?


    (2)用负染法制片时,磷钨酸钠或礴钨酸钾起什么作用?


    (3)你还知道哪些电子偏光显微镜样品制备技术?你认为可以用透射电镜观察样品内部结构而用扫描电镜观察样品表面结构吗?

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